
SEVENTH COMMISSION DIRECTIVE of 1 March 1976 establishing Community methods of analysis for the official control of feedingstuffs (76/372/EEC) (repealed) 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Article 1 
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Article 2 
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Article 3 
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ANNEX
DETERMINATION OF AFLATOXIN B1
A. ONE-DIMENSIONAL THIN LAYER CHROMATOGRAPHIC METHOD 
 1. Purpose and scope 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 2. Principle 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3. Reagents 
 3.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.14. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.15. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.16. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.17. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.18.5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4. Apparatus 
 4.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5. Procedure 
 5.1. Preparation of the sample (see under‘Observations’, Part C, point 1). 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.2. Extraction 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.3. Column clean-up 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.4. Thin-layer chromatography 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5. Quantitative determinations 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.1. Visual measurements 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.2. Measurements by fluorodensitometry 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.6. Confirmation of the identity of aflatoxin B1 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.6.1. Treatment with sulphuric acid 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.6.2. Two-dimensional chromatography involving the formation of aflatoxin B1-hemiacetal (aflatoxin B2a) 
 5.6.2.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.6.2.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.6.2.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 6. Calculation of the results 
 6.1. From the visual measurements 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 6.2. From the fluorodensitometric measurements 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 7. Preparation and testing of the standard solution (3.16) 
 7.1. Determination of the concentration of aflatoxinB1 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 7.2. Testing of chromatographic purity 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 8. Repeatability 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 9. Reproducibility 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

B. DETERMINATION OF AFLATOXIN B1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD 
 1. Purpose and scope 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 2. Principle 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3. Reagents 
 3.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.5.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.5.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.5.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.12.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.13.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.14. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.14.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.15. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.15.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 3.15.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4. Apparatus 
 4.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.13. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.14. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.15. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.16. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.17. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.18. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.19. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.21. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.22. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.23. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.24. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.24.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 4.24.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5. Procedure 
 5.1. Preparation of the sample. 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.2. Test portion. 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.3. Extraction 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.4. Clean-up (the procedure should be carried out without significant interruptions). 
 5.4.1. Florisil SEP-PAK purification 
 5.4.1.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.4.1.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.4.2. C18 SEP-PAK purification 
 5.4.2.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.4.2.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5. High performance liquid chromatography 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.1. HPLC pump settings 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.2. Post-column pump settings 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.3. Fluorescence detector 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.4. Injector 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.5. Check of chromatographic separation 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.6. Check of the stability of the system 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.7. Check of linearity 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 5.5.8. Injection of sample extracts 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 6. Confirmatory test 
 6.1. Further treatment of the extract (5.4.2.2) 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 6.2. Preparation of derivative and thin layer chromatography: 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 7. Calculation of results 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 7.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 8. Repeatability: 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 9. Reproducibility: 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 10. Observations 
 10.1. Precision 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 10.2. Stabilization of chloroform (3.1) 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 10.3. Accuracy 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C. OBSERVATIONS CONCERNING METHODS A AND B 
 1. Defatting 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
 2. Reproducibility of the results for Method A 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Appendix to Annex
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
